Ретровируси (Retroviridae)
Вирус на Човешкия Имунен Дефицит (Human Immunodeficiency virus - НІV)
ИСТОРИЯ
През 1980 и 1981 г. независимо една от друга, две изследователски групи – в САЩ и Япония - изолираха човешки Т-клетъчен лимфотропен вирус (НТLV-I), който е първият доказан човешки ретровирус – етиологичен фактор на човешката Т-клетъчна левкоза у възрастни. Тази левкоза се открива в около 5% от лицата, заразени с НТLV-I и е с продължителен (около 30 години) латентен период. Вирусът причинява в различна степен дисфункция на имунната система с модификация на клиничното протичане на редица инфекции. HTLV-2 (изолиран в 1982 г.) се предава по кръвен и полов път и също се асоциира с някои форми на миелопатия.
През 1981г. Gottlieb и съавтори описаха за първи път Синдрома на Придобитата Имунна Недостатъчност (СПИН), който се характеризира с рязко намаляване броя на CD4+ лимфоцитите, с последващо отслабване на имунната защита.
През 1983 г. френски екип, ръководен от Л. Монтание изолира вируса-причинител на СПИН – известен днес като HIV. Днес инфекцията НІV/СПИН е с пандемично разпространение (вж. 43).
У нас работата по СПИН започна през 1985 г. след внасянето на хронично заразената с HIV-1LAI H9/HTLV III линия, предоставена на Р. Аргирова от Р. Гало. През 1987 г. на територията на НЦЗПБ бе организирана и Централната Лаборатория по СПИН. Същата година започна и задължителния контрол на кръвната банка за НІV-антитела.
КЛАСИФИКАЦИЯ
Според последната класификация на вирусите (вж. Глава 3) сем. Retroviridae се отнася към група VІ – РНК съдържащи вируси, осъществяващи репликацията си чрез обратна транскрипция. Човешките ретровируси HTLV-I и HTLV-II се отнасят към род Deltavirus, а вирусите, причинители на СПИН – към род Lentivirus.
МОРФОЛОГИЯ
Връзката между отделните представители на сем. Retroviridae почива на общност в морфологичните, антигенните и молекулярно-биологичните им свойства. Всички те имат необичаен цикъл на репликация на генетичния си материал (РНК-ДНК-РНК), притежават собствен вирионен ензим – РНК-зависима-ДНК-полимераза (обратна транскриптаза - RT, ревертаза) с няколко активности. RT осъществява процеса на обратната транскрипция (РНК – ДНК). Всички представители на сем. Retroviridae имат уникалното свойство да се интегрират като ДНК-провирус в ДНК на хромозомите на заразените клетки и в такъв вид се съхраняват и размножават заедно с тези клетки. Ретровирусите съществуват в две форми – вириони, носещи РНК като генетичен материал и ДНК провирус – интегриран в заразените клетки.
НІV може да бъде разглеждан като морфологичен прототип на всички Retroviridae. Всички те са с висока степен на изменчивост, докато ДНК провирусът на всички представители е генетически стабилен.
НІV-1 (Фигура 32) е грубосферичен с размер от 120 nm в диаметър, обвит с липопротеинова мембрана, произхождаща от клетката, в която вирусът се е формирал. Капсидът, разположен в матрикс, включва две копия от едноверижна, 9 kb РНК с положителна полярност.
ДНК-провирусът на НІV-1 (Фигура 33) съдържа в двата си края идентични по структура дълги крайни повтори, а от 5’ към 3’-края са разположени 3 структурни гена – gag, pol и env. Тези гени кодират структурни белтъци - отговорни за прикрепването на вируса към клетката, фузията, репликацията, интеграцията, сглобяването, зреенето и освобождаването на вириона. Еnv генът кодира вирусните гликопротеини – gp120 и gp41, участващи в прикрепването и навлизането на вириона в клетката чрез фузия. Gag генът кодира структурните белтъци – матриксен (р17), капсиден (р24), нуклеокапсиден (р7). Pol генът кодира няколко собствени вирионни ензима – протеаза (PR), обратна транскриптаза (RT), РНК-хибридаза (РНКазаН), ДНК-зависима-ДНК-полимераза и интеграза (IN), които осигуряват биохимично протичането на репликацията. Вирусният геном кодира и 6 неструктурни белтъци, два от които (Tat и Rev) са регулаторни протеини, а останалите 4 гена (nef, vif, vpr и vpu) се определят като аксесорни (допълнителни), тъй като не са абсолютно необходими за репликацията на вируса ин витро. ДНК-провирусът на НІV-2 се различава от този на НІV-1 по наличието на гена vpx вместо vpu.
РЕПЛИКАЦИЯ
По-долу ще разгледаме репликацията на НІV-1, която принципно не се различава от тази на НІV-2.
Ранната фаза на вирусния репликативен цикъл започва с прикрепването на вируса към клетката и завършва с интеграцията на провирусната ДНК – кДНК (copy, cDNA).
Гликопротеините на НІV-1 са конструирани като тримери и служат за закрепване на вириона към клетката и последващото му проникване. Основният клетъчен рецептор за НІV е CD4 молекулата, която може да се открие по клетъчната повърхност в около 60% от Т-лимфоцитите, Т-клетъчни предшественици в тимуса, моноцити/макрофаги, еозинофили, дендритни клетки и микроглиални клетки от централната нервна система.
Експресията на CD4 рецептора не е достатъчна за да осигури навлизането на НІV в клетката, защото вирусните изолати заразяват човешки клетки независимо, че CD4 върху тях не са експресирани. Това доведе до откриването и изясняването на ко-рецепторен механизъм за навлизането на вируса.
В зависимост от това какъв ко-рецептор използват отделните вирусни изолати на НІV-1, последните се категоризират с различна тропичност. М-тропните вируси инфектират макрофаги, свързвайки се с тях чрез CCR5 ко-рецепторна молекула. Обикновено М-тропните изолати не индуцират образуване на синцитии, откриват се в началото на НІV-инфекцията и най-често характеризират половия път на предаването й. Обратно, Т-тропните вируси инфектират CD4+ Т-клетките, използвайки CXCR4 молекулата като ко-рецептор и индуцират синцитии. Образуването на синцитии под действие на НІV е лош прогностичен белег, появява се обикновено при по-напреднала инфекция. При подобряване на състоянието (след лечение) е обратим. Съществуват и трети тип - М/Т-тропни изолати с двоен тропизъм, които могат да заразяват и двата вида клетки.
CCR5 е главен корецептор, необходим за навлизането на M-тропните HIV-1 вируси. Взаимодействието между HIV-1, CD4 и CCR5 на повърхността на антиген-представящите клетки представлява “входната врата” за проникване на HIV-1 в човешките клетки. Интерес предизвика фактът, че някои индивиди остават незаразени независимо, че са изложени на повтарящи се контакти с вируса. Доказано бе съществуването на генетични разновидности на CCR5, които имат отношение към невъзприемчивостта към инфекция с HIV-1, а вероятно и към различаващата се прогресия на инфекцията при засегнатите индивиди. Детайлни проучвания в гена, кодиращ CCR5 установиха наличие на 32-базова делеция (del32CCR5) в двата алела на кодиращата област (хомозиготен генотип). Делецията води до продукция на дефектен ко-рецептор, представляващ скъсен, нефункционален рецепторен протеин, неспособен да свърже HIV-1, като по този начин предотвратява заразяването с вируса.
Индивидите хомозиготи по del32 в ССR5 по дефиниция са генетично невъзприемчиви към инфекция с М-тропни HIV-1 изолати и голяма част от многократно експонираните неинфектирани с HIV-1 индивиди са именно такива, тъй като най-често първичната инфекция се осъществява от М-тропни вируси. Изолираните случаи на HIV-позитивни лица, хомозиготни по del32 могат да се обяснят с инфекция с двойнотропни варианти.
Хетерозиготни носители на делецията (мутацията се открива само върху единия алел на гена) са възприемчиви към HIV-1 инфекцията, но при тях се наблюдава бавното й прогресиране към СПИН. Наши изследвания показват, че 7 ± 0,09% от българското население са хомозиготи по del32CCR5. Сред 177 изследвани българи, живеещи с НІV, не е открит нито един хомозиготен по del32.
След свързването на gp120 към CD4 от прицелната клетка, в гликопротеина възникват конформационни промени, водещи до откриването на високоафинитетно свързващо място за ко-рецепторната молекула. Тези конформационни промени водят до дисоциацията на gp120 от gp41 и откриването на фузогенната зона на gp41. Самото проникване на вирусната частица става чрез вмъкване на gp41 фузионния пептид в мембраната на клетката, което води до фузията на вирусната и клетъчната мембрани и освобождаването на вирусната сърцевина в цитоплазмата. Веднага след попадането на вирусната сърцевина в цитоплазмата, започва процесът на обратна транскрипция . Вирусната (+) РНК служи като матрица за синтез на първата верига провирусна ДНК.
Този сложен процес е резултат от няколко ензимни реакции:
- Синтез на ДНК верига, комплементарна на вирусната РНК, като се получава ДНК-РНК хибрид ( РНК-зависима-ДНК-полимераза);
- Разграждане на РНК-ДНК - хибрида чрез РНКаза-хибридазна активност, като от хибрида се отделя единична верига ДНК;
- Синтез на втора ДНК верига, комплементарна на първата ( ДНК-зависима-ДНК-полимераза).
Интегрирането на провирусната ДНК става в ДНК на заразената клетка и се осъществява от ензима интеграза. Процесът представлява серия от реакции на срязване и присъединяване. Дотук репликацията на HIV се осъществява от вирионни ензими и се счита за сравнително автономен процес. Образувалият се ДНК- провирус остава пожизнено в клетката.
Транскрипцията и транслацията на провирусната ДНК се осъществява от ензимния апарат на инфектираната клетка с участието на вирусни транскрипционни фактори.
Узряването на вирусната частица до голяма степен зависи от активността на вирус-специфичната протеаза. Тя разцепва белтъците-предшественици до структурни белтъци. Последният стадий на репликацията е освобождаването на вирусната частица чрез пъпкуване. В Т-клетките пъпкуването става на клетъчната повърхност, а освобождаването на вирусните частици - в екстрацелуларното пространство. В моноцитите и макрофагите вирионите се събират в клетъчните вакуоли.
В процеса на репликацията на ретровирусите се допускат грешки – само по време на обратната транскрипция стават 1-10 грешки на геном на репликационен цикъл. Мутациите водят до възникване на репликативно-некомпетентни вируси. Мутациите, акумулиращи се под действие на селекционната преса на антиретровирусните медикаменти, често стават доминантни и компрометират супресията на вирусната репликация. Грешките при репликацията, заедно с бързия кръговрат на вирионите ( всеки ден в кръвния ток постъпват нови 109 вирусни частици и толкова се изчистват) обуславят вирусно поколение от близки, но нееднакви вириони, означавано като квазиспециес.
Всички вирусни ензими, участващи в репликацията на НІV, нямат аналог в човека (с изключение на ДНК-зависимата-ДНК-полимераза). Следователно, те са идеалните мишени за антиретровирусна терапия.
ЧУВСТВИТЕЛНОСТ
НІV е силно чувствителен към всички видове липидни разтворители и детергенти, вкл. съдържащите се в сапуните и праховете за пране. Издържа не повече от 60 минути при 37єС и приблизително толкова при 56єС. Достатъчна е обработката на повърхността (дрехи, прибори), върху която е капнала капка кръв от НІV(+) лице с дезинфектант, спирт или липоразтворител, за да се инактивира НІV. Вирусът обаче е много издържлив на ниска температура – замразяване в границите -70єС до -196єС практически го съхраняват.
ПАТОГЕНЕЗА
Специфичният имунен отговор срещу НІV се индуцира най-мощно от дендритните клетки, които обработват и пренасят вирусните антигени до вторичните лимфни органи, където става активирането на антиген-специфичните Т-клетки. Вирусната репликация е интензивна още в ранната фаза на инфекцията. По това време се наблюдава взривоподобна виремия, последвана бързо от намаляването й. Налице е силен специфичен цитотоксичен отговор, който у повечето пациенти съвпада със супресията на виремията. Макрофагите, активираните и неактивираните CD4+ клетки са главните мишени на НІV, като през цялото време на инфекцията лимфната тъкан е главното място за репликация на вируса – съдържанието на провирусна ДНК е 5 – 10 пъти по-високо от това в циркулацията. НІV се акумулира главно в лимфните възли. В неактивираните CD4+ клетки се представя като неинтегрирана ДНК, докато в активираните – предимно като интегриран провирусен геном, предпоставка за продукция на нови вириони. При пациенти на лечение с НААRT броят на продуктивно заразените CD4+ клетки силно намалява, но във всички случаи остава едно депо от латентно заразени неактивирани CD4+ клетки, които поддържат вирусната репликация. С напредването на НІV инфекцията броят на CD4+ клетките бавно намалява като плазмената виремия постоянно се покачва. Лимфните възли постепенно се разрушават, което допринася допълнително за активиране и заразяване на нови CD4+ клетки – процес, водещ до разпространяване на НІV в целия организъм. Имунната система отслабва прогресивно, показател за което е неспособността й да се справи с опортюнистични инфекции. Именно те оформят клиничната картина в края на инфекцията, като стават непосредствена причина за смъртта.
ОСНОВНИ ЗАБОЛЯВАНИЯ, ПРЕДИЗВИКАНИ ОТ НІV
НІV-1 и НІV-2 причиняват хронична инфекция, прогресираща към СПИН, както и тежко заболяване на централната нервна система (ЦНС), известно днес като НІV-асоциирана деменция (ХАД). Днес се счита, че ХАД е най-важната причина за деменция у лица под 40-годишна възраст, както и най-високо рисковият фактор за смърт при настъпване на СПИН. ХАД се описва най-общо като синдром на когнитивна и моторна дисфункция. С въвеждането на HAART болестността от ХАД се изчислява на около 10,5% сред хората, живеещи с НІV, но се набелязва тенденция за повишаването й. Развитието на ХАД е много по-вероятно при нисък брой на CD4+ клетки. Като ключова за НІV инфекцията на ЦНС се счита кръвно-ликворната бариера. Смята се за доказано, че НІV заразява макрофагите и микроглията, които преминават тази бариера, но не и невроните въпреки, че последните умират като резултат от апоптоза. Те се увреждат индиректно, от свръхстимулация на токсини, освободени от заразените макрофаги, микроглия и астроцити. Лечението е много трудно поради това, че далеч не всички медикаменти преминават кръвно-ликворната бариера.
ЛАБОРАТОРНА ДИАГНОСТИКА
Доказването и проследяването на инфекцията с НІV е комплексно и включва специфични лабораторни, клинични и клинико-лабораторни изследвания, диагностициране на различните опортюнистични инфекции, определяне на имунния статус и др. Логично е да се приложат следните два подхода: 1) определяне (качествено и/или количествено) на отделни вирусни маркери за доказване и проследяване хода, прогнозата и резултатите от приложение на антивирусна терапия и 2) избор на метод, в зависимост от целите на изследването и качествата на използвания лабораторен тест според чувствителност, специфичност, възпроизводимост, надеждност и приложимост.
Изключително важно е да се знаят и тълкуват не само резултатите от лабораторното изследване в даден момент, но да се познава и динамиката на вирусните маркери в хода на инфекцията. Определени маркери биха подсказали давността на инфекцията, клиничния стадий, прогнозата и ефекта от приложеното лечение.
Методи за доказване на инфекция с HIV
След 10-тия ден до VІ седмица от заразяването с НІV в кръвта циркулира вирус, най-често определим като вирусен антиген (общ или р24 антиген), чийто титър се повишава до към ІV седмица, след което бавно спада.
Многобройните методи за доказване на НІV инфекцията се разделят на следните три групи: 1) за първично тестиране (скрининг); 2) за потвърдително изследване и 3) за научноизследователни цели (вкл. и мониториране на антиретровирусната терапия).
Методите за първично тестиране (скрининг), както и потвърдителните методи откриват антитела срещу вируса, докато методите за научноизследователски цели определят директно самия вирус или негови характерни компоненти. Потвърдително изследване се предприема само след двукратно положителен резултат в скрингово изследване.
Изолирането на HIV е труден процес, изискващ специална вирусологична, биохимична или молекулярно-биологична квалификация, както и специално пригодени за това лабораторни условия и не е рутинен. Директното доказване на вируса днес се заменя с количествено определяне броя на HIV РНК копията в плазмата на лица, получаващи антиретровирусна терапия. Същият метод е незаменим и при окончателната диагностика на НІV статуса у новородени от НІV(+) майки. При инфекцията с вируса на СПИН в кръвта циркулират едновременно антигени и антитела – това означава, че циркулиращите антивирусни антитела нямат неутрализиращо, респ. протективно действие. Те обаче са високо специфични и се използват за диагностични цели.
Интерпретация на резултатите от скрининговите изследвания
НІV-положителният резултат по ELISA означава, че лицето вече е срещнало вируса и е реагирало с образуване на антитела – т.е. лицето е НІV(+) серопозитивно, вирусоносител. Диагнозата СПИН се поставя само от клиницист въз основа на приетата от Центъра за контрол на болестите дефиниция и клинична класификация, приета и у нас. Въпреки прогреса на биотехнологията, съществуват около 1% фалшивоположителни резултати. Не съществува “идеален” тест за НІV по отношение на чувствителност и специфичност. Опитът показва, че такива резултати най-често се получават при болни или преболедували от малария (хиперекспресия на DR-HLA антигени), системни автоимунни заболявания или такива с хипергамаглобулинемия. Ето защо в световната практика е възприето положителните по ELISA резултати да се изследват с потвърдителни методи. Затова резултатът от ELISA никога не се съобщава на изследваното лице, преди да е предприето второ изследване на същия серум или плазма. Повторно положителният резултат в ЕLISA задължава изследване чрез потвърдителен тест. Като потвърдителен тест се използва методът Western blot (WB)
Резултатът, определян чрез метода WB, може да бъде 3 вида:
- Отрицателен – върху нитроцелулозната мембрана не се визуализира никакъв банд – няма антитела към нито един вирусен протеин;
-Положителен – изявяват се най-малко 2 банда – напр. задължително поне 1 банд- продукт на env плюс/минус поне един продукт на gag или на pol гена.
- Неопределен – изявяват се бандове , но в нетипичната комбинация, за да се приеме то положителен резултат. Неопределеният WB не трябва да се интерпретира като несигурен лабораторен резултат, а като находка, изискваща допълнително наблюдение и изследване. Неопределеният резултат не е окончателен резултат. В този случай лицето трябва да бъде изследвано отново след 1 – 3 месеца. Повторното изследване на серумна проба 1 – 3 месеца след откриването на неопределен резултат по WB може да покаже следните резултати: 1) разгръщане на находката до положителен резултат –обикновено у контактни на НІV(+) лица, венозни наркомани и др. с рисково поведение;
2) изчезване или намаляване на находката – т.е. негативиране - у тези лица неопределеният резултат е бил неспецифичен. Такъв резултат може да се появи и при изследване на хемолизирал серум; 3) персистиране на находката - отнася се отново за неспецифична находка, нямаща нищо общо с инфекция с вируса на СПИН.
Нашият и световният опит, както и знанията ни за сероконверсията при инфекция с НІV, днес позволяват само едно проследяване на нова серумна проба – 1 - 3 месеца след първия неопределен резултат.
Положителен резултат (по методите ELISA + WB) означава, че лицето е заразено с НІV, т.е. носител е на вируса, причиняващ СПИН и може да зарази други лица. Подобен резултат НЕ означава, че лицето е болно от СПИН или че непременно ще развие СПИН.
Отрицателен резултат (по методите ELISA + WB) означава, че в кръвта на изследвания няма антитела към НІV към момента на изследването. Отрицателен резултат по същите методи НЕ означава, че лицето не е заразено с НІV – възможно е тестът да е проведен по време на прозоречния период; че лицето може да осъществява сексуален контакт без предпазни средства или че лицето е невъзприемчиво към НІV.
Неопределен резултат в WB изисква:
Следващо изследване (1-3 месеца след първото), тъй като е възможно сероконверсията да не е напълно завършена. В случай, че лицето има признаци на остра инфекция, незабавно се прави количествен тест за НІV РНК. Ако изследването на серумна проба след този срок покаже отрицателен резултат (ELISA + WB), това означава, че към момента на второто изследване лицето не е заразено с НIV, а първият серум е показал фалшиво-положителен резултат.
Новородени от НІV(+) майки
Рискът от предаване на НІV от бременна жена на фетуса (плода, новороденото) в Европа намаля до 1% благодарение на разработените специализирани лечебни протоколи. У новородените от НІV(+) майки, НІV-антитела пасивно придобити от майката циркулират до около 12 – 15 месечна възраст. Предаването им става трансплацентарно след 30-та седмица на бременността и тези антитела нямат протективен ефект. Към 8–9-ия месец интензивността на бандовете в WB намалява –признак, че е започнал процесът на елиминация на майчините антитела. Изследването чрез WB се препоръчва паралелно за майката и детето. Изключването на инфекция с НІV е възможно чрез PCR – най-добре е тя да се изпълни към края на 1-вия месец, за да се избегне възможна контаминация с майчин вирус. При получаване на положителен резултат тестът трябва непременно да се повтори с нова кръвна проба. НІV-инфекция у новороденото със сигурност се изключва след двукратно отрицателен резултат по PCR: първата PCR между 1-вия и 4-тия месец и следващата – след 4-тия месец. Счита се, че ако първата проба по PCR е положителна, най-вероятно се касае за интраутеринно заразяване. В случай, че първата проба е отрицателна, а втората – положителна, това най-вероятно означава, че заразяването е станало перинатално (при раждането). Тъй като кърменето носи риск от заразяване с НІV, новороденото следва да се храни изкуствено.
Пост-експозиционната профилактика (за медицински работници) изисква:
Съставяне на протокол за инцидента, подписан от свидетелите на инцидента (напр. участниците в операцията или хирургическата манипулация ).
Незабавно изследване за НІV антитела на пострадалия или персонала и по възможност на пациента (непременно се иска информирано съгласие).
Ако пациентът със съмнения за НІV в момента е отрицателен, шансът за медицинския работник до голяма степен е той също да е отрицателен.
Повторно изследване на пострадалия за НІV-антитела поне 6 седмици след инцидента само при положителен резултат след отрицателен такъв при първото изследване (т. 2) може да се приеме НІV-инфекция в резултат на експозиция.
Ако пациентът е НІV(+) незабавно се започва терапия, за което се съобщава в МЗ.
На всяко операционно работно място денонощно трябва да е осигурен т. нар. начален (стартиращ) пакет с антиретровирусни медикаменти.
Лечението на НІV/СПИН както и препаратите, влизащи в състава на HAART са разгледани отделно в 12-Б.
